雞ELISA（酶聯免疫吸附試驗）檢測試劑盒是家禽疾病診斷、抗體水平監測及疫苗效果評估的重要工具，通過特異性抗原-抗體反應，定量或定性檢測雞血清、組織液等樣本中的病原體抗原、抗體或細胞因子濃度。本文以間接ELISA為例，系統梳理檢測流程的關鍵步驟，確保實驗結果的準確性與可靠性。
一、實驗前準備：試劑與樣本的標準化處理
試劑盒通常包含預包被酶標板、酶標抗體、標準品、樣本稀釋液、洗滌液、顯色液及終止液。
使用前將試劑盒各組分平衡至室溫（20-25℃）30分鐘，避免溫度差異導致反應不穩定。
2.樣本采集與保存
血清樣本：采集雞翅靜脈血，室溫靜置2小時后，3000 rpm離心10分鐘，取上清分裝至EP管，-20℃保存（避免反復凍融）。
組織勻漿液：取100 mg組織（如脾臟、法氏囊），加入1 mL PBS緩沖液研磨，離心后取上清。
注意事項：溶血、脂血或微生物污染的樣本需重新采集，否則可能干擾檢測結果。
二、操作流程：分步驟執行ELISA檢測
1.加樣與孵育
標準品稀釋：按說明書將標準品梯度稀釋（如1:2、1:4、1:8……），繪制標準曲線。
樣本加樣：在酶標板孔中加入100 μL稀釋后的樣本或標準品，設復孔（通常雙孔），空白孔僅加稀釋液。
孵育：37℃孵育60分鐘（或根據試劑盒要求調整），使抗原-抗體充分結合。
2.洗滌與封閉
洗滌：棄去孔內液體，每孔加入300 μL洗滌液，靜置30秒后甩干，重復5次。
封閉（可選）：若試劑盒包含封閉液，孵育30分鐘以減少非特異性結合。
3.酶標抗體孵育與顯色
加入酶標二抗（如HRP標記的抗雞IgG），37℃孵育30分鐘，再次洗滌。
每孔加入100 μL TMB顯色液，避光孵育15-20分鐘，觀察顏色變化（藍色為陽性反應）。
4.終止反應與讀數
每孔加入50 μL終止液（如2 M H2SO4），顏色由藍變黃。
15分鐘內用酶標儀測定450 nm波長處的OD值（以630 nm為參比波長）。
三、數據分析與結果判定
1.標準曲線繪制
以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，使用四參數邏輯回歸（4PL）或線性回歸擬合曲線，確保R2≥0.99。
2.樣本濃度計算
根據樣本OD值代入標準曲線方程，計算抗原/抗體濃度；若低于檢測限，報告為“最小檢測值”。
3.結果判定
定性檢測：以Cut-off值（通常為陰性對照OD均值×2.1）為閾值，OD值≥Cut-off判為陽性。
定量檢測：對比疫苗免疫后抗體滴度變化（如NDV抗體效價≥4 log2），評估免疫效果。
四、注意事項與質量控制
1.交叉反應：避免檢測與目標抗原/抗體有交叉反應的物質（如其他禽類病毒抗體）。
2.室內質控：每批實驗設置陽性、陰性對照及質控品，確保OD值在預期范圍內。
3.重復性驗證：對同一樣本進行3次平行檢測，變異系數（CV）應＜15%。
結語：標準化操作提升檢測效能
雞ELISA檢測試劑盒的操作需嚴格遵循說明書，通過規范化的樣本處理、孵育條件控制及數據分析，確保結果的準確性與重復性。未來，隨著多指標聯檢試劑盒與自動化檢測平臺的發展，ELISA技術將在雞病快速診斷、種群健康監測及生物安全防控中發揮更大作用，助力家禽養殖業的高效與可持續發展。
在線客服
電話咨詢
